补肾活血汤治疗股骨头坏死的分子靶点及机制网

0 引言 Introduction

股骨头坏死是骨科常见的疑难病之一，其发病原因尚不明确，可分为创伤性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死2 大类，临床表现为髋关节疼痛、跛行及功能障碍[1]。目前，股骨头坏死的治疗主要是药物保守治疗和手术疗法。药物治疗仅局限于改善临床症状，而手术治疗一般采用髓芯减压和全髋关节置换等修复方法，存在创伤大、费用高及术后并发症多等缺陷。中医药对股骨头坏死的治疗有积极作用，尤其对于早中期患者，可延缓病程进展，有效改善患者临床症状，推迟全髋关节置换的时间[2]。中医学认为本病属于“骨蚀”“骨痹”“骨痿”范畴，致病原因以痰、瘀、虚为主，与肝、脾、肾密切相关，病机多属肝肾亏虚，气滞血瘀，治疗上多以补益肝肾，活血化瘀为主，使肝肾之气充盈，瘀血散去，经络通畅，骨得营血之濡养。

补肾活血汤，出自《伤科大成》，由红花、当归、肉苁蓉、山茱萸、枸杞子、菟丝子、熟地黄、杜仲、没药、独活和补骨脂共11 味中药组方而成，有补益肝肾、强筋壮骨、活血止痛之功效。补肾活血汤以及其化裁方在长期的临床实践中取得了较好的疗效。曾宪峰等[3]通过随机平行对照研究发现补肾活血汤可显著改善髋关节症状，疗效明显；滕佳文[4]根据临床病例观察证实补肾活血汤可明显减轻髋部疼痛，还能改善血液微循环、纠正脂质代谢紊乱；张翔等[5]实验说明补肾活血方可通过调节APNAMPK 信号通路中脂联素、肿瘤坏死因子α 的表达，对股骨头坏死发挥有效干预。

网络药理学是以系统生物学为基础，对特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。网络药理学强调药物的多分子多靶标多途径调节，提升药物疗效，降低毒副作用，从而提高新药研发效率，节省药物的研发费用[6-7]。

由于补肾活血汤中药物所含化学成分多且较为复杂，并且在分子水平上治疗股骨头坏死的作用机制尚不明确，因此文章拟通过网络药理学从分子水平探究补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在活性成分及作用机制，为后期的深入研究、实验验证及新药研发提供一定的理论依据。

1 资料和方法 Data and methods

1.1 补肾活血汤中成分收集与筛选 借助中药系统药理学分析平台(TCMSP， 和中医药综合数据库(TCMID， 中获得。

口服生物利用度是ADME 中重要的药动学参数之一，它表示口服药物的有效成分或活性基被吸收到达体循环并被吸收的速度与程度，口服生物利用度值越高通常表示药物的类药性越好[8-9]。因此筛选出红花、当归、肉苁蓉、山茱萸、枸杞子、菟丝子、熟地黄、杜仲、没药、独活和补骨脂化合物中符合口服生物利用度≥30%且药物类药性≥0.18 的化学成分作为活性成分。

1.2 靶标蛋白的筛选及药物-归经-化合物-靶点网络的构建 将筛选出的补肾活血汤中的活性成分输入到TCMSP平台进行检索(其中补骨脂活性成分的靶标蛋白通过TCMID 获取)，查找出相关靶标蛋白，借助Uniprot 数据库( 3.7.2 软 件(

1.3 补肾活血汤治疗股骨头坏死潜在作用靶点预测 在GeneCards Version 4.14数 据 库( 毒性与基因比较数据库( of the femoral head”为关键词，规定物种为“Homo Sapiens”，检索与股骨头坏死相关疾病靶点。通过韦恩图将“1.2”中筛选出的药物靶点与相关疾病靶点进行映射取交集，得到补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点。

1.4 蛋白互作(PPI)网络构建及蛋白模块筛选与分析 将“1.3”项下得到的交集靶点导入STRING 数据库( 选 择“Multiple Proteins” 并 将“Organism” 规 定 为“Homo sapiens”， 获 得 蛋 白 互 作关系，数据保存为TSV 格式。利用Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化处理，“Network analyzer”功能进行网络拓扑属性分析。运用Cytoscape 3.7.2 软件的MCODE 插件筛选PPI 中的蛋白模块[15]，以Degree Cutoff=5，Node Score Cutoff=0.2，k-core=2，=100作为筛选参数，筛选关键蛋白模块，将“1.3”项下得到的交集靶点输入Metascape 数 据 库( Analysis”进行蛋白模块分析。

1.5 基因富集分析 将补肾活血汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点利用DAVID 数 据 库[17]( 完成基因本体论(Gene Ontology，GO)及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)信号通路富集分析，设定阈值P＜ 0.05，分别选取生物学过程、分子功能和细胞组成中富集基因数排名前10 的条目运用GraphPad Prism 8.0 软 件( 信号通路富集分析选择与疾病关的信号通路用Omicshare 云平台(

2 结果 Results

2.1 补肾活血汤中活性成分的筛选 通过TCMSP 及TCMID 检索到红花、当归、肉苁蓉、山茱萸、枸杞子、菟丝子、熟地黄、杜仲、没药、独活、补骨脂中化合物共1 427 个，其中189 个来自红花，125 个来自当归，75 个来自肉苁蓉，226 个来自山茱萸，188 个来自枸杞子，29 个来自菟丝子，76 个来自熟地黄，119 个来自杜仲，276 个来自没药，99 个来自独活，25 个来自补骨脂。以口服生物利用度≥30%且药物类药性≥0.18，筛选出活性化合物167个，其中22 个来自红花，2 个来自当归，6 个来自肉苁蓉，20 个来自山茱萸，45 个来自枸杞子，11 个来自菟丝子，2 个来自熟地黄，25 个来自杜仲，45 个来自没药，9 个来自独活，10 个来自补骨脂。补肾活血汤中部分活性化合物基本信息见表1。

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